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肿瘤细胞培养实验
点击次数:55 发布时间:2019-10-09
实验方法原理肿瘤组织及细胞在模拟体内生长环境的条件下、与一般组织细胞一样、也能够生长发育乃至繁殖、为研究癌变机理、抗癌药检测、肿瘤分子生物学提供大量的实验材料。
实验材料

肿瘤组织

试剂、试剂盒

培养液Hanks胰蛋白酶EDTA胶原酶

仪器、耗材

培养瓶培养皿吸管和胶帽眼科剪眼科镊二氧化碳培养箱超净工作台

实验步骤

一、取材

 

人肿瘤细胞来自外科手术或活检瘤组织。取材部位非常重要,体积较大的肿瘤组织中有退变或坏死区,取材时尽量避免用退变组织,要挑选活力较好的部位。癌性转移淋巴结或胸腹水是好的培养材料。取材后宜尽快进行培养,如因故不能立即培养,可贮存于4 ℃中,但不宜超过24 小时。

 

二、培养基

 

肿瘤细胞对培养基的要求不如正常细胞严格,一般常用的RPMI 1640、DMEM、Mc-Coy5A等培养基等皆可用于肿瘤细胞培养。肿瘤细胞对血清的需求比正常细胞低,正常细胞培养不加血清不能生长,肿瘤细胞在低血清培养基中也能生长。肿瘤细胞对培养环境适应性较大,是因肿瘤细胞有自泌(Autocrine)性产生促生长物质之故。但这并不说明肿瘤组织完全不需要这些成分。按不同细胞需要不同的生长因子;肿瘤细胞与正常细胞之间、肿瘤细与肿瘤细胞之间对生长因子的需求都存在着差异。但大多数肿瘤细胞培养中仍需要生长因子,有的还需特异性生长因子(如乳腺癌细胞等)。总之培养肿瘤细胞仍需加血清和相关生长因子培养更易成功。

 

三、成纤维细胞的排除

 

成纤维细胞常与肿瘤细胞同时混杂生长,致难以纯化肿瘤细胞。而且成纤维细胞常比肿瘤细胞生长得快,最终能压制肿瘤细胞的生长。因此排除成纤维细胞成为肿瘤细胞培养中的关键。排除成纤维细胞有多种方法。

 

(1)刮除法:镜下观察肿瘤细胞,并在培养瓶或培养皿底部做下标记,再用无菌胶刮刮除无标记区域。

    

(2)反复贴壁法:肿瘤细胞贴壁速度比成纤维细胞慢,把含有两类细胞的悬液反复贴壁,则成纤维细胞先贴壁而肿瘤细胞后贴壁,来达到分离两类细胞的目的。

 

取A、B、C三个培养瓶,先于A中接种入两种细胞的无血清培养基悬液,5~20min后轻轻将上清液吸出,接种至B,A中加入完全培养基继续培养;培养B中细胞5~20min后,同样方法将上清接种至C,再于C中加入完全培养基。次观察三瓶细胞,会发现成纤维细胞A>B>C,C瓶中主要为肿瘤细胞,如需纯化,可反复处理。

    

(3)酶消化法:成纤维细胞对酶更为敏感,故加入胰酶或胶原酶消化的时候比肿瘤细胞更易于脱落。可于镜下观察消化,待成纤维细胞脱落即刻终止消化,反复处理几次可得较纯的肿瘤细胞。

   

(4)复苏、传代和冻存同前。

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