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人滑膜细胞培养实验
点击次数:44 发布时间:2019-10-09
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实验方法原理

滑膜细胞是衬于关节内表面的细胞性内膜和内膜下层,分为A型滑膜细胞(滑膜巨噬细胞)和B型滑膜细胞(滑膜成纤维细胞).其中A型细胞最显著的功能是吞噬作用和胞饮作用,该型细胞具有吞噬坏死细胞碎屑及病理状态下关节腔内其他物质的功能;B型细胞的功能是合成输出蛋白且与透明质酸酶的形成密切相关,同时与透明质酸酶相联系的小数量蛋白亦来自滑膜成纤维细胞,透明质酸酶参与滑液形成起润滑作用。

实验材料
滑膜组织 
试剂、试剂盒Ⅰ型胶原酶胎牛血清α-MEM 
仪器、耗材手术器械培养皿细胞滤网培养瓶 
实验步骤一、实验方法
 

1. 将切下的组织在手术台上请护士将标本放入低温生理盐水中(静止),在手术完成时将标本放入PBS冰水液中并放入消毒的容器中带回实验室。

 

2. 在超净台中将标本放入培养皿中,加入α-MEM 洗涤。

 

3. 获得组织切开,仔细辨认于关节反折处及增生的白色光滑的滑膜组织,附于关节软骨面的增生的血管翳也为滑膜组织(可作另一管消化),仔细剔除脂肪组织,用α-MEM 洗二次(以去除红细胞),放在小青瓶中用解剖剪锐性切碎。

 

4. 用双倍获得组织的体积含有4 mg/mlⅠ型胶原酶的α-MEM 消化37℃孵育120分钟(在此期间震动混匀数次)。

 

5. 30 分钟后收集第yi管细胞:细胞悬液经70 um 细胞滤网过滤,用1500-2000转离心6分钟,上清为Ⅰ型胶原酶加入未过滤网的组织,继续用于消化。

 

6. 离心管底细胞用α-MEM 离心洗涤2 次,每次用α-MEM 重悬浮后用1500-2000 转,离心6 分钟,最后一次用记数板观察到有细胞。细胞最终悬浮于含有10%胎牛血清的α-MEM 中,接种到培养瓶中培养。

 

7. 60 钟后收集第二管细胞:细胞悬液经70 um 细胞滤网过滤,用 1500-2000 rpm 离心6 分钟;用α-MEM 洗2 次,每次用α-MEM 重悬浮后用1500-2000  rpm 离心6 分钟,最后一次用记数板观察细胞并计数。细胞最终悬浮于α-MEM 含有10%胎牛血清中,接种到培养瓶中培养。

 

8. 必要时可做第三管细胞收集;并立即作原代滑膜细胞培养。

 

9. 每 2-3 天换液一次。

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注意事项

1. 取材要保证新鲜无菌,可用培养液及冰块暂时保存,并尽快进行分离

培养。

 

2. 剪切滑膜组织时应尽量剪碎,以剪碎至1 mm3的小块为宜。

 

3. 滑膜组织冲洗尽量仔细,以冲去组织块上血细胞及脂肪组织等。

 

4. 补加培养液时应缓缓加入,避免将已贴附的组织块冲起,导致分离培养失败。

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